口腔龋病被列为影响人类健康的三大疾病之一，属于牙体硬组织的细菌感染性疾病，没有细菌就不会发生龋病。变形链球菌(Streptococcusmutans)是目前公认的与龋病发病关系最为密切的致龋菌。采取有效措施杀灭或抑制口腔内微生物是预防和控制龋病的有效措施之一，但口腔微生物定植比较复杂，控制难度较大。
低温等离子体杀菌技术近年来有较大发展，在很多领域得到成功的应用，在医疗器械灭菌方面尤为突出。中国科学院物理研究所设计制造的低温等离子体针使等离子体在口腔内应用成为现实。为研究该低温等离子体针对口腔内定植菌杀灭效果，我们以口腔内主要致龋菌即变形链球菌为模型，在实验室内进行了杀菌效果观察。现将研究结果报告如下。
1、材料和方法
1.1实验材料试验用低温等离子体针由中国科学院物理研究所研制，用石英管作为阻挡介质，由内、外电极通过石英介质阻挡放电，产生等离子体，再通过石英材料制作的漏斗形装置聚焦输出形成针状。等离子体针内外电极分别与波形发生器(CTP-K)相连（图1），可直接作用于人手及其他皮肤组织无热感和痛感。
图1低温等离子针作用示意图
试验菌株为变形链球菌(S.mutans)标准株，编号为UA，由本实验室保存菌种。培养基采用牛，心脑浸液和琼脂培养基培养，染菌载体使用滤纸片和去脂玻璃片。
1.2实验方法
1.2.1染菌载体制备将试验菌经分离培养得到单个典型菌落，接种液体培养基培养过夜，得到纯培养菌悬液。使用螺旋接种仪取菌悬液均匀接种于BHI琼脂培养基，制备成带菌平板。染菌载体是将5μl菌液滴染在直径5mm无菌滤纸片上，室温干燥后备用。
1.2.2载体杀菌试验(1)对培养基平板上细菌杀灭处理：等离子体处理条件为：以流速为0.1m3?h-1氦气和26ml?min-1氧气为气，电压为V，距离1.5cm，照射20s。等离子体处理后，将培养基平板置于CO2培养箱培养36h，观察结果，初步了解等离子体对变形链球菌的杀灭效果。
(2)对纸片上细菌杀灭处理：等离子体处理条件为：以流速为0.1m3?h-1氦气和26ml?min-1氧气为载气，电压为V，距离1.5cm，照射20～s，每组3个菌片。另取3个菌片，仅用氦气和氧气处理，不加载电压，不产生等离子体，作为阳性对照。将等离子体处理染菌滤纸片，移入含有1ml生理盐水的离心管中，震荡洗脱1min，洗下菌体，取样液涂抹接种于BHI琼脂培养基进行细菌计数。
1.2.3生物膜杀灭试验将直径5mm的无菌去脂玻璃片放入培养皿中，加入稀释好的变形链球菌菌液没过玻璃片，置于CO2培养箱中孵育16h，使玻璃片表面生成单一菌种的生物膜。将培养皿从CO2培养箱中取出，吸去菌液，加入约10ml生理盐水，放于脱色摇床上震摇1min，洗去浮游和粘附不紧密的细菌。完成3次洗涤后，将长有细菌生物膜的小玻片浸泡于生理盐水中待用。取1个玻片，于无菌滤纸上轻吸去多余液体，放置于无菌平皿中，等离子体照射处理。以流速为0.1m3?h-1氦气和26ml?min-1氧气为载气,激发电压～V，距离1.5cm，处理时间20s。按上述方法处理对照组，每个条件处理3个玻片，作为平行对照。将处理后的玻片放入含1ml灭菌生理盐水的离心管中(管中有直径3mm的玻璃珠)，蜗旋振荡器上振1min，洗下菌体,取样液涂抹接种于BHI琼脂培养基进行细菌计数。
1.2.4等离子体作用后细菌形态观察将无菌玻璃片与稀释好的菌液共孵育4h，使细菌初步粘附于玻璃片上。用生理盐水洗涤后，按上述条件进行等离子体照射处理。处理后的带菌波片用浓度为25g/L戊二醛固定，磷酸缓冲液漂洗，10g/L锇酸固定，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥和离子溅射仪镀膜。然后在扫描电镜(JSM-LV,JEOL)下观察并拍照。
2、结果
2.1载体杀菌试验结果BHI琼脂培养基平板上变形链球菌经激发电压V、照射距离1.5cm、低温等离子处理20s，等离子针处理形成边界锐利、直径约7mm的圆形细菌密度减低区，即等离子体作用的有效杀菌区域(图2)。
图2等离子体处理BHI琼脂平板上细菌减少示意图
染菌载体经等离子体针照射20s，对载体上变形链球菌平均杀灭对数值为1.87，即平均杀灭率为98.65%。在上述条件下等离子体照射s时,平均杀灭对数值为2.48,平均杀灭率为99.67%(表1)。随着等离子体处理时间的延长,杀菌效果逐渐增强。
表1等离子体针对纸片上细菌灭杀试验结果
2.2等离子体对生物膜的杀灭效果在激发电压为V时,距离1.5cm，处理20s条件下，等离子体针对玻片上变形链球菌生物膜平均杀灭对数值为3.43，平均杀灭率为99.96%(表2)。随着激发电压的增加，等离子体对变形链球菌生物膜的杀灭效果逐渐增强。
表2低温等离子体针对变形链球菌生物膜杀效果
2.3等离子体作用后细菌形态观察结果经扫描电镜观察发现，在倍电镜视野下，等离子体处理前，玻片表面的细菌分布均匀，细菌呈典型的链状排列（图3A)。经低温等离子体针照射处理后，玻片上细菌只有少数分散菌体，菌数明显减少(图3B)。放大00倍电镜视野下，等离子体处理前的菌体边界清晰，形态饱满（图3C）。经低温等离子体针照射处理后，扫描电镜可见细菌胞壁和胞膜破裂，胞质外溢，细胞皱缩，失去原有形态，仅残存一些细胞碎片（图3D）。
图3A处理前放大倍玻片上细菌
图3B处理后放大倍玻片上细菌
图3C处理前放大00倍玻片上细菌
图3D处理后放大00倍玻片上细菌
3、讨论目前，口腔科主要使用化学消毒剂对窝洞和根管进行消毒，常用消毒剂为次氯酸钠。次氯酸钠由于具有良好的广谱抗菌性和组织溶解，在国外广泛应用于临床窝洞消毒，并作为根管冲洗剂在根管化学机械预备中起重要作用。但由于国内未普遍使用橡皮障和四手操作，次氯酸钠的刺激性、腐蚀性较强和不良气味限制了其临床的使用。
低温等离子体的杀菌作用已逐渐被人们所认识，大量研究报道证明等离子体对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌黑色变种芽孢以及白色念珠菌均有较强的杀灭作用。低温等离子体在口腔临床消毒方面主要特点是其无色无味、不产生副产物和有毒残留物；等离子体可以充满整个窝洞或根管系统，杀菌不留死角，从而获得良好的消毒和治疗效果。本研究结果证明，低温等离子体针对琼脂培养基表面、纸片上细菌个体和玻片上生物膜都具有一定的杀灭作用，并且等离子体对皮肤无痛无损害。另外，本研究选取变形链球菌作为试验指标菌，该菌公认是致龋病原菌，因此本试验结果为探索低温等离子体针用于龋病防治提供科学依据。
关于低温等离子体杀菌机理尚无确切定论，有研究总结性地指出，等离子体中所包含的活性氧原子、氧分子以及等离子体所产生的辐射将破坏细菌的细胞膜、DNA及蛋白质，从而起到杀菌的作用。研究用扫描电镜观察到，温等离子体针处理前后的变形链球菌部分菌体细胞完整性受到破坏，胞质外溢，此可能与细胞壁、膜的破裂有关。等离子体致细胞膜破裂主要是由脂肪酸的过氧化、电荷累积、高速电子冲击以及外加电场在细胞膜上产生瞬间电势超过临界值所致。
本研究结果显示，低温等离子体针对于口腔主要致龋菌变形链球菌杀灭效果可靠。作者：刘筱娣、杨思泽等
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